Примечание редакции. Доклинический эксперимент не доказывает эффективности или безопасности для человека. Хроническая гипоксия отличается от интервального протокола; выводы о механизмах не являются показаниями к лечению или самостоятельному применению препаратов. Ниже размещена редакционная текстовая версия русскоязычной статьи. Большие таблицы и графики сохранены в исходном PDF; на странице приведены краткие результаты и ссылки на нужные страницы оригинала. Это научный материал, не инструкция по лечению.
Редакционная форма материала: подробное изложение исходной публикации, а не дословное воспроизведение. Данные и атрибуция сохранены; исправления распознавания сверены с PDF.
Кратко о публикации
- Эксперименты выполнены на крысах линии Вистар, изолированных сердцах и кардиомиоцитах.
- Изучали повреждение при ишемии-реперфузии и влияние блокаторов различных опиоидных рецепторов.
- Использована хроническая гипоксическая экспозиция, а не клинический курс IHHT на OXYTERRA RS.
Основной текст
Введение
Опиоидная система и цель эксперимента
Ранее авторы показали роль опиоидной системы в кардиопротекции при адаптации к хронической нормобарической гипоксии [3]. Однако рецепторная специфичность и локализация участвующих опиоидных рецепторов (ОР) оставались неясными.
Цель исследования: изучение локализации опиоидных рецепторов, обеспечивающих кардиопротекторный эффект адаптации к хронической нормобарической гипоксии, и оценка рецепторной специфичности этого феномена.
Материал и методы
Хроническая нормобарическая гипоксия
Эксперимент выполнен на самцах Вистар массой 250–300 г. Их адаптировали 21 день в камере при нормальном атмосферном давлении. Содержание O₂ поддерживали в пределах 11,75–12,25%, CO₂ — 0,03% [13, 16]. Смесь создавал прибор «Био-нова-204G4R1» (НТО Био-нова, Москва, Россия).
O₂ и CO₂ в камере непрерывно контролировали датчиками TCOD-IR и OLC 20 через блок MX32 (Oldham, Франция).
Модель ишемии-реперфузии
Ишемию миокарда (20 мин) моделировали путем перевязки левой коронарной артерии у животных, наркотизированных с помощью пентобарбитала натрия (60 мг/кг, внутрибрюшинно, Sanofi-Aventis, Франция). Продолжительность последующей реперфузии составила 180 мин [16]. Во время выполнения процедуры крысы находились на искусственной вентиляции, которую осуществляли с помощью модифицированного аппарата “РО-6” (ОАО “Красногвардеец”, Санкт-Петербург, Россия).
После ишемии и реперфузии сердце выделяли и промывали физиологическим раствором через канюлированную аорту. Для определения размера зоны гипоперфузии (зона риска – ЗР) проводили окраску сердца насыщенным раствором перманганата калия через аорту, правый желудочек удаляли и взвешивали. Срезы толщиной в 1 мм производили перпендикулярно продольной оси сердца [16]. Для определения зоны некроза (ЗН) срезы окрашивали 1%-м раствором 2,3,5-трифенил тетразолия хлорида (30 мин, 37 °C) и на 1 сутки помещали в 10%-й раствор формальдегида.
На следующий день после окрашивания срезы сканировали с обеих сторон (сканер HP Scanjet G2710). ЗР и размер некроза определяли компьютеризированным планиметрическим методом. Величина очага инфаркта (ЗН) была выражена в процентах от области гипоперфузии. Во избежание погрешностей, связанных с сезонным изменением чувствительности сердца к действию ишемии-реперфузии, контрольные опыты проводили параллельно с каждой серией экспериментов.
Блокаторы рецепторов in vivo
До коронароокклюзии адаптированным животным внутривенно вводили физиологический раствор либо один из блокаторов. Налоксона метиодид, не проходящий ГЭБ блокатор всех подтипов ОР, вводили по 5 мг/кг за 25 мин до ишемии [14].
Блокатор δ-рецепторов TIPP(ψ), H-Tyr-TicPψ-[CH₂NH]-Phe-Phe-OH, вводили по 0,5 мг/кг за 25 мин [2]. Селективный δ₁-блокатор BNTX (Benzylidenenaltrexone maleate) — по 0,7 мг/кг за 25 мин [14]. Селективный δ₂-блокатор налтрибен — по 0,3 мг/кг за 25 мин [14].
Налтрибен и BNTX предварительно растворяли в 0,1 мл DMSO, а затем в 1 мл в 20%-м растворе hydroxypropyl- β-cyclodextrin, остальные субстанции – в 0,9%-м растворе NaCl.
Все вышеназванные препараты вводили в объеме 0,2 мл.
Ранее нами было показано, что у неадаптированных крыс блокаторы опиоидных рецепторов в использованных дозах не влияют на соотношение “ЗН/ЗР” [14].
Выделение кардиомиоцитов
Кардиомиоциты выделяли энзиматическим методом [5]. У крыс после пентобарбитала 60 мг/кг и гепарина 5000 МЕ/кг выполняли шейную дислокацию и стернотомию. Сердце быстро иссекали и до остановки сокращений помещали в раствор Тирода при +4 °C. Состав, мМ: 140 NaCl, 5,4 KCl, 1 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂·6H₂O.
Кроме того, раствор содержал 10 мМ глюкозы, 5 мМ HEPES и 1,6 г/л бычьего сывороточного альбумина (БСА). Аорту канюлировали для ретроградной перфузии. Выделение занимало 25–30 мин при 10 мл/мин, 37 °C и pH=7,4. Растворы предварительно насыщали 95% O₂ и 5% CO₂.
Метаболическое ингибирование и контроль
В буфер добавляли коллагеназу Yakult 600000 ЕД/л и протеазу XIV 0,230 г/л; перфузию продолжали 7–12 мин. Затем 4 мин использовали раствор Тирода без ферментов. Сердце отсекали, левый желудочек выделяли и диспергировали в 5 мл буфера с 10 г/л БСА.
Клетки стабилизировали 1 ч в CO₂-инкубаторе Sanyo (Япония), при +28 °C и 5% CO₂. Для имитации ишемии в методах описано 25-минутное метаболическое ингибирование без аэрирования при pH=7,4. Буфер содержал, мМ: 118 NaCl, 25 NaHCO₃, 4,7 KCl, 1,2 MgSO₄, 1,2 KH₂PO₄, 20,0 2-дезоксиглюкозы и 1,5 NaCN.
Контрольные клетки ресуспендировали в бескальциевом растворе Кребса, pH=7,4. Состав, мМ: 118 NaCl, 25 NaHCO₃, 11 глюкозы, 4,7 KCl, 1,2 MgSO₄ и 1,2 KH₂PO₄.
После ингибирования надосадочную клеточную суспензию собирали и оставляли в буфере Тирода на 30 мин для имитации реперфузии. Выживаемость оценивали микроскопически по трипановому синему. К 100 мкл суспензии добавляли 10 мкл красителя. Подсчитывали доли погибших синих и выживших неокрашенных клеток. Гибель при ишемии-реперфузии выражали в процентах от контроля с буфером Кребса.
Блокаторы в клеточной модели
Ингибиторы добавляли к изолированным кардиомиоцитам за 25 мин до ишемии. Налтрексон — блокатор всех ОР — использовали в концентрации 1 мкМ [9]. Для μ-ОР применяли CTAP 1 мкМ [7], для δ-ОР — TIPP(ψ) 0,1 мкМ [15], для δ₂-ОР — налтрибен 10 мкМ.
Статистическую обработку результатов производили, используя программу STATISTICA 6.0 с помощью t-критерия Стьюдента для нормально распределенных величин и критерия Манна–Уитни для распределений, отличающихся от нормального. Результаты выражали как среднее арифметическое (М)±стандартная ошибка средней (SEM).
Результаты и обсуждение
Размер зоны некроза
Исследования показали (табл. 1), что ЗН у неадаптированных крыс составляет около 56% от зоны гипоперфузии, а у крыс, адаптированных к хронической гипоксии, – 20,4% от ЗР, что достоверно ниже чем в группе животных, не подвергшихся адаптации (р<0,01). Это свидетельствует о том, что адаптация к хронической нормобарической гипоксии оказывает выраженный кардиопротекторный эффект.
При блокаде периферических ОР налоксона метиодидом у адаптированных животных зона некроза выросла с 21,1 до 46,5%, приблизившись к контролю. Авторы связывают кардиопротекцию адаптации с активацией периферических ОР. Число 21,1 в повествовании сохранено, хотя в таблице адаптационного контроля указано 20,4%.
Показатели эксперимента in vivo
| Группа | n | МПЖ, мг | МЛЖ, мг | Зона риска, мг | Зона некроза, мг | ЗН/ЗР, % |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Неадаптированный контроль | 15 | 207±15,0 | 861,9±44,9 | 337,5±27,6 | 142,3±21,2 | 56,5±2,9 |
| Адаптация | 18 | 256,1±12,8; p<0,05 | 760,5±28,2 | 360,4±23,6 | 142,9±23,5 | 20,4±1,7; p<0,01 |
| Адаптация + налоксона метиодид, 5 мг/кг | 12 | 478±36,8 | 1021,2±46,8 | 205,5±43,6 | 429,4±22,6 | 46,5±6,95; p₁<0,01 |
| Адаптация + TIPP(ψ), 0,5 мг/кг | 13 | 293,2±12,6 | 831,4±32,8 | 372,9±17,5 | 209,1±13,8 | 56,1±4,1; p₁<0,01 |
| Адаптация + налтрибен, 0,3 мг/кг | 11 | 275,3±7,1 | 885,5±37,4 | 266,4±24,3 | 146,6±18,4 | 54,9±4,1; p₁<0,01 |
| Адаптация + BNTX, 0,7 мг/кг | 11 | 276,6±7,8; p₁<0,01 | 848,4±24,2 | 293±33,6 | 34,4±5,9 | 13,6±3,07; p₁<0,01 |
| Адаптация + CTAP, 0,1 мг/кг | 12 | 307,5±8,8 | 896,8±33,7 | 369,6±32,5 | 181,7±36,9 | 49±9,3; p₁<0,01 |
Роль δ₁-, δ₂- и μ-рецепторов
Как следует из указанной таблицы, блокада d-ОР селективным антагонистом TIPP( ) у адаптированных животных приводила к увеличению индекса ЗН/ЗР более чем на 30% по отношению к таковым показателям в группе адаптационного контроля. В результате соотношение “зона некроза/зона риска” оказалось равным таковому в контрольной группе неадаптированных крыс. Эти данные указывают на то, что δ-ОР принимают участие в формировании кардиопротекторного эффекта адаптации к гипоксии. Известно, что δ-ОР подразделяются на два субтипа: δ₁-ОР и δ₂-ОР [8]. На фоне блокады δ₁-ОР селективным антагонистом BNTX размер ЗН, относительно показаний у адаптированных животных, не изменялся, то есть защитный эффект адаптации к хронической гипоксии сохранялся. “Выключение” δ₂-ОР селективным блокатором налтрибеном у животных, подвергшихся адаптации, приводило к увеличению индекса ЗН/ЗР с 20,4 до 54,9%, и этот показатель терял достоверные отличия от группы неадаптированного контроля.
Полученные данные позволяют аргументировать то, что в кардиопротекторном эффекте адаптации к хронической нормобарической гипоксии важную роль играют δ₂-ОР.
Предварительная блокада µ-ОР их селективным блокатором СТАР приводила к устранению кардиопротекторного эффекта адаптации, на что указывает увеличение размера инфаркта миокарда (ЗН/ЗР) до контрольных значений.
Результаты на изолированных клетках
Результаты исследований in vivo были подтверждены в опытах на изолированных кардиомиоцитах (табл. 2). В ходе экспериментов было показано, что ишемия вызывает гибель 15,1±0,6% клеток, выделенных из миокарда неадаптированных крыс. Напротив, число погибших кардиомиоцитов, выделенных из миокарда адаптированных к хронической гипоксии крыс, составило после ишемии лишь 6,7±0,7%. Эти данные опять-таки говорят в пользу защитного эффекта хронической гипоксии.
Добавление налтрексона к клеткам адаптированных крыс сопровождалось гибелью 11,1±1% кардиомиоцитов. Достоверного отличия от неадаптированного контроля не было.
В таблице 1 массы зон и желудочков представлены в мг, ЗН/ЗР — в процентах. Числа таблицы и повествования не пересчитывались и не согласовывались редакцией.
Примечание редакции: у налоксона метиодида в таблице 1 масса некроза превышает массу зоны риска, а опубликованное отношение им не соответствует. Несогласованность содержится в оригинале. Погрешности в таблице 2 также отличаются от сокращённых значений в повествовательном тексте; сохранены обе формы.
Таким образом, при налтрексоне авторы не наблюдали защитного эффекта адаптации. Они рассматривают это как подтверждение зависимости кардиопротекции от активации ОР.
Селективная блокада и гибель клеток
При CTAP реоксигенационная гибель клеток адаптированных крыс составляла 10,34±2,1%. При блокаде δ-ОР — 9,52±1%, при налтрибене — 10,67±0,9%. Авторы отмечают отсутствие защитного эффекта при селективном ингибировании δ₂- и μ-рецепторов.
Таким образом, результаты опытов на изолированных кардиомиоцитах подтверждают данные, полученные на модели острой коронароокклюзии и последующей реперфузии.
Сопоставление с дельторфином II
Кардиопротекторный эффект активации опиоидных рецепторов был известен и ранее. Так, в опытах с 45-минутной коронароокклюзией и 2-часовой реперфузией миокарда крыс нами было показано, что активация δ₂-опиоидных рецепторов их селективным агонистом дельторфином II приводит к уменьшению показателя ЗИ/ОР. Инфаркт-лимитирующий эффект дельторфина II, как правило, сохраняется после инъекции антагониста δ₁-ОР BNTX, но не проявляется после блокады δ₂-ОР налтрибеном [14]. При этом нам так и не удалось выявить инфарктлимитирующий эффект дельторфина II после блокады периферических ОР метиодидом налоксона (5 мг/кг).
Следовательно, повышение толерантности сердца к действию ишемии-реперфузии под действием дельторфина II может быть следствием активации периферических δ₂- ОР. Эти данные полностью согласуются с результатами настоящей работы, которые свидетельствуют о важной роли δ₂-ОР в формировании защитного эффекта адаптации к хронической нормобарической гипоксии.
По оценке авторов, в доступной им литературе не было данных об инфаркт-лимитирующем действии селективных μ-агонистов. Однако их результаты допускают защитную роль эндогенных μ-агонистов.
| Воздействие | Контроль, n=8: погибшие клетки, % | Хроническая гипоксия, n=10: погибшие клетки, % |
|---|---|---|
| Ишемия-реперфузия | 15,17±6,41 | 6,69±0,69; p=0,017391 |
| Налтрексон, 1 мкМ | 11,84±5,10 | 11,10±6,2 |
| CTAP, 1 мкМ | 12,28±6,38 | 10,34±5,79 |
| TIPP(ψ), 0,1 мкМ | 11,98±0,74 | 9,52±0,89 |
| Налтрибен, 10 мкМ | 10,47±5,94 | 10,67±3,77 |
Возможное объяснение — разные подтипы μ-ОР для эндогенных и экзогенных агонистов. Одни могут не менять устойчивость к ишемии-реперфузии, другие — повышать толерантность клеток к гипоксии-реоксигенации. Это гипотеза обсуждения, а не установленная в работе селективность агонистов.
Локализация рецепторов и интерпретация
Следующий раздел нашей работы был посвящен изучению вопроса о внутрисердечной или экстракардиальной локализации периферических опиоидных рецепторов, отвечающих за кардиопротекторный эффект хронической гипоксии.
Известно, что на сарколемме кардиомиоцитов находятся δ- и µ-опиоидные рецепторы [11, 12]. Полученные нами ранее данные говорят о том, что при адаптации животных к хроническому стрессу в крови увеличивается содержание β-эндорфина и стресс-гормонов [4]. Установлено также, что опиоидные пептиды (такие как в-эндорфин, мет-энкефалин) могут синтезироваться в ткани миокарда из высокомолекулярных предшественников [6, 10]. Следовательно, можно предположить, что в условиях адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии опиоидные пептиды могут активировать опиоидные рецепторы, расположенные на мембранах кардиомиоцитов.
Наши эксперименты с изолированными клетками сердца свидетельствуют о том, что µ- и δ₂-опиоидные рецепторы, принимающие участие в реализации протекторного эффекта адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии, расположены в кардиомиоцитах. Это согласуется с данными об участии δ-ОР в реализации кардиопротекторного эффекта ишемического прекондиционирования и адаптации к гипобарической гипоксии [1, 2, 17].
В литературе по ишемическому прекондиционированию важная роль отводится δ₁-ОР [17]. В данном эксперименте защитный эффект хронической непрерывной гипоксии исчезал после блокады δ₂-, а не δ₁-рецепторов. Также результаты указывают на участие кардиальных μ-ОР. Авторы подчёркивают различие механизмов этих видов прекондиционирования.
Заключение
Заключение
Авторы заключают, что кардиопротекция при адаптации к непрерывной нормобарической гипоксии связана с кардиальными δ₂- и μ-ОР. Селективную стимуляцию этих рецепторов они предлагают изучать как перспективу профилактики ишемических и реперфузионных повреждений. Это доклиническое заключение по хронической гипоксии у крыс.
Таблицы и иллюстрации оригинала
Краткие результаты приведены в начале страницы. Полные наборы показателей, исследовательские протоколы и графики доступны в исходном PDF.
Ишемия-реперфузия и блокаторы рецепторов: PDF, страница 3
Экспериментальные результаты и заключение: PDF, страница 4
Литература
Источники 1–5
1. Лишманов Ю.Б., Нарыжная Н.В., Крылатов А.В. и др. Роль опиатных рецепторов и АТФ-зависимых калиевых каналов митохондрий в формировании адаптационной устойчивости миокарда к аритмогенному действию ишемии и реперфузии // Известия РАН. Серия биологическая. – 2003. – № 6. – С. 720–727.
2. Лишманов Ю.Б., Нарыжная Н.В., Маслов Л.Н. и др. Опиатергическое звено антиаритмического эффекта адаптации к гипоксии на модели ишемии и реперфузии in vivo // Пат. физиол. экспер. тер. – 2003. – № 1. – C. 19–21.
3. Лишманов Ю.Б., Нарыжная Н.В., Цибульников С.Ю. и др. Роль µ-, δ- и к- опиоидных рецепторов в формировании кардиопротекторного эффекта адаптации к хронической нормобарической гипоксии // Сибирский медицинский журнал. (Томск) – 2012. – Т. 27, № 1. – C. 111–114.
4. Лишманов Ю.Б., Трифонова Ж.В., Цибин А.Н. Бета-эндорфин и стресс-гормоны плазмы крови при состояниях напряжения и адаптации // Бюл. эксперим. биологии и медицины – 1987. – № 4. – С. 422–424.
5. Borchert G.H., Yang C., Kolаr F. Mitochondrial BKCa channels contribute to protection of cardiomyocytes isolated from chronically hypoxic rats // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2011. – Vol. 300(2). – P. H507–513.
Источники 6–10
6. Caffrey J.L., Boluyt M.O., Younes A. et al. Aging, cardiac proenkephalin mRNA and enkephalin peptides in the Fisher 344 rat // J. Mol. Cell. Cardiol. – 1994. – Vol. 26. – P. 701–711.
7. Devidze N., Zhang Q., Zhou J. et al. Presynaptic actions of opioid receptor agonists in ventromedial hypothalamic neurons in estrogen- and oil-treated female mice // Neuroscience. – 2008. – Vol. 152, No. 4. – P. 942–949.
8. Dhawan B.N., Cesselin F., Raghubir R. et al. International union of pharmacology. XII. Classification of opioid receptors // Pharmacol. Rev. – 1996. – Vol. 48, No. 4. – P. 567–592.
9. Ebrahimi F., Tavakoli S., Hajrasouliha A.R. et al. Involvement of endogenous opioid peptides and nitric oxide in the blunted chronotropic and inotropic responses to beta-adrenergic stimulation in cirrhotic rats // Fundam. Clin. Pharmacol. – 2006. – Vol. 5. – P. 461–471.
10. Forman L.J., Bagasra O. Demonstration by in situ hybridization of the proopiomelanocortin gene in the rat heart // Brain Res Bull. – 1992. – Vol. 28. – P. 441–445.
Источники 11–14
11. Head B.P., Patel H.H., Roth D.M. et al. G-protein-coupled receptor signaling components localize in both sarcolemmal and intracellular caveolin-3-associated microdomains in adult cardiac myocytes // The Journal of Biological Chemistry. – 2005. – Vol. 280, No. 35. – P. 31036–31044.
12. Insel P.A., Head B.P., Ostrom R.S. et al. Caveolae and lipid rafts: G protein-coupled receptor signaling microdomains in cardiac myocytes // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2005. – Vol. 1047. – P. 166– 172.
13. Kong X., Tweddell J.S., Gross G.J. et al. Sarcolemmal and mitochondrial K(atp)channels mediate cardioprotection in chronically hypoxic hearts // J. Mol. Cell. Cardiol. – 2001. – Vol. 33, No. 5. – P. 1041–1045.
14. Maslov L.N., Lishmanov Yu.B., Oeltgen P.R. et al. Activation of δ peripheral 2 opioid receptors increases cardiac tolerance to ischemia/reperfusion injury: Involvement of protein kinase C, NO-synthase, KATP channels and the autonomic nervous system // Life Sci. – 2009. – Vol. 84, No. 19–20. – P. 657–663.
Источники 15–18
15. Nancy A.M., Maguerite T.T, Paul L.P. Agonist Activity of the d- Antagonists TIPP and TIPP-c in cellular models expressing endogenous or transfected d-opioid receptors // JPET. – 2002. – Vol. 98, No. 1. – P. 240–248.
16. Neckar J., Szarszoi O., Herget J. et al. Cardioprotective effect of chronic hypoxia is blunted by concomitant hypercapnia // Physiol. Res. – 2003. – Vol. 52. – P. 171–175.
17. Schultz J.E.J., Hsu A.K., Gross G.J. Ischemic preconditioning in δ the intact rat heart is mediated by 1- but not µ- or к-opioid receptors // Circulation. – 1998. – Vol. 97. – P. 1282–1289.
18. Zhu M., Cho Y.K., Li C.S. Activation of delta-opioid receptors reduces excitatory input to putative gustatory cells within the nucleus of the solitary tract // J. Neurophysiol. – 2009. – Vol. 101, No. 1. – P. 258–268.
Технология и практика
От механизмов адаптации к процедурам: кислородные режимы и биофидбэк в IHHT.