Гипоксия и гипероксия изучались как отдельные режимы воздействия в эксперименте на крысах. Авторы оценивали морфометрические и биохимические изменения ткани лёгких.
Примечание редакции. Эксперимент на животных с раздельными режимами газовых воздействий. Его нельзя представлять как исследование эффективности или безопасности IHHT у человека. Наблюдавшиеся изменения соединительной ткани при гипероксии подчёркивают зависимость ответа от дозы и режима воздействия. Ниже дано подробное редакционное изложение предоставленной русскоязычной публикации, а не дословное воспроизведение. Таблицы и иллюстрации доступны в неизменённом исходном PDF. Это научный материал, не инструкция по лечению.
Кратко о публикации
- В эксперименте использованы 36 крыс, распределённых на контрольную, гипоксическую и гипероксическую группы.
- Воздействия проводились 28 дней; гипоксию и гипероксию применяли в разных группах, а не последовательно в одном сеансе IHHT.
- Оценивались морфометрия респираторного отдела и маркеры соединительной ткани лёгких.
Гипоксия и гипероксия: данные публикации
Соединительная ткань лёгких и газовые воздействия
По статистическим данным за 2010 г., смертность от патологии органов респираторной системы в Украине находится на 3-м месте после сердечно-сосудистых заболеваний и онкологии [1]. При патологии органов дыхания часто происходит разрастание (фиброз) соединительной ткани (CТ) легких, что приводит к угнетению их функциональной активности [2]. Поэтому поиск новых путей и методов предупреждения развития фиброза и оптимизации процессов газообмена в легких является актуальным и целесообразным.
В последние годы значительное внимание уделяют исследованиям, направленным на изучение действия на организм человека и животных газовых смесей (ГС) с различным парциальным давлением кислорода (РО₂). Полученные разными авторами данные по изучению влияния гипо- и гипероксических ГС на состояние респираторного отдела легких различаются. Это может быть связано с неодинаковыми условиями проведения экспериментов: применение разного уровня РО₂, режимов и длительности подачи ГС, использование лабораторных животных разного возраста и т. д. [3–7] .
В экспериментах, результаты которых приведены в данной статье, использована гипоксическая ГС саногенного уровня (10 % кислорода в азоте) [8]. Ее позитивное влияние показано на функционировании многих органов и систем организма [3, 7, 9]. Также исследована гипероксическая ГС с 40%-ным содержанием кислорода, которую часто применяют в клинике для устранения различных форм гипоксии.
Цель и экспериментальные группы
Целью работы явилось исследование влияния дозированной гипо- и гипероксической ГС на морфометрические показатели респираторного отдела и состояние СТ в легких молодых крыс.
Материалы и методы
Эксперимент длился 28 сут. на 36 половозрелых самцах крыс Вистар 3-месячного возраста. Исходная масса тела составляла в среднем 280±10 г. Выделили контрольную группу и две группы раздельных газовых воздействий.
Крыс 2-й группы помещали в герметичную камеру. Ежедневно через мембранный газораспределительный элемент подавали смесь с 10 % кислорода в азоте. Прерывистый режим состоял из 3 циклов: 10 мин дезоксигенации и 30 мин реоксигенации. В 3-й группе ежедневно подавали нормобарическую гипероксическую смесь с 40 % кислорода в течение 60 мин.
Все животные получали стандартный рацион со свободным доступом к воде и корму. Из эксперимента их выводили под эфирным наркозом, соблюдая международные принципы Европейской конвенции о защите позвоночных животных.
Гистологические и биохимические методы
По окончании эксперимента были отобраны образцы ткани легких для гистоморфологических и биохимических исследований. Гистологические препараты изготавливали по стандартной методике: образцы ткани фиксировали в жидкости Буэна, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином Бемера – эозином и 2%-ным кислым пикрофуксином в сочетании с железным гематоксилином Вейгерта (модифицированный метод окраски СТ по Ван-Гизону) [10]. Микропрепараты фотографировали на микроскопе Olympus(Япония).
Морфометрию выполняли в программе IMAGE J. На срезах измеряли средний диаметр, глубину и площадь поперечного сечения альвеол, а также ширину входа в альвеолу. Определяли толщину межальвеолярной перегородки (МП), диаметры респираторных бронхиол (РБ), альвеолярных ходов (АХ) и мешочков (АМ). Для измерений выбирали срезы с хорошо различимыми АХ и альвеолами [11].
Концентрация общего оксипролина в ткани легких определялась фотометрически, методом окисления гидроксипролина с хлорамином Т (метод Т. П. Кузнецовой и др.).
Полученные данные обрабатывались методами вариационной статистики с помощью програмного обеспечения Statistica for Windows 6.0 и программы Microsoft Exel 2010. Достоверность различий между контрольными и экспериментальными группами оценивались по t-критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Масса лёгких и общая морфология
Увеличение массы легких на 17 % (р< 0,05) по сравнению с контролем наблюдалось только у животных 2-й группы, которые вдыхали гипоксическую ГС. Возрастание общей массы легких может быть связано с полнокровием капилляров сосудистого русла. Известно, что дыхание гипоксическими ГС увеличивает кровенаполнение и ускоряет микроциркуляцию в органах и тканях за счет раскрытия резервных капилляров, а также образования новых, ранее не существовавших сосудов [8, 12]. На выполненных срезах полнокровие сосудов после влияния гипоксической ГС также подтверждено.
После вдыхания гипероксической ГС изменений общей массы легких не происходило. Этот факт можно рассматривать как подтверждение европейских установок на отсутствие ощутимых повреждений легких при дыхании ГС с 40%-ным содержанием кислорода.
Большая часть альвеол легкого у крыс 2 и 3-й групп находилась в нормальном состоянии, меньшая часть – в состоянии физиологического ателектаза, или умеренного расширения. На гистологических срезах трудно отчетливо разглядеть структурное различие между АХ и АМ. Поэтому их рассматривают как одну группу. Также не всегда удается различить РБ и АХ. Следовательно, не представляется возможным строго разграничить эти классы [11].
Изменения альвеол при гипоксии
Морфометрические показатели состояния респираторного отдела легких под влиянием подачи гипо- и гипероксической ГС изменялись по-разному. Так, после влияния гипоксической ГС (10 % кислорода) отмечена тенденция к увеличению среднего диаметра, глубины, площади поперечного сечения альвеол, ширины входа в альвеолу и ширины РБ, АХ и АМ по сравнению с контролем. Соотношение ширины входа в альвеолу к ее глубине имело тенденцию к снижению (см. таблицу). Таким образом, вдыхание гипоксической ГС в прерывистом режиме увеличивает общую площадь альвеолярной поверхности, воздушность легких, однако не достигает размеров, типичных для эмфизематозного состояния. Это способствует возрастанию эффективности газообмена легких.
Изменения альвеол при гипероксии
После воздействия гипероксической ГС (40 % кислорода) морфометрические показатели респираторного отдела легких изменялись в обратном направлении. Достоверно снижались средний диаметр и глубина альвеолы (на 20 % и 21 % соответственно) по сравнению с контролем. При этом площадь поперечного сечения альвеолы уменьшилась на 43 % (р<0,05). Показатели ширины входа в альвеолу и ширины РБ, АХ и АМ имели лишь тенденцию к снижению. Отношение ширины входа в альвеолу к ее глубине у крыс 3-й группы было выше, чем в контроле на 15 % (см. таблицу).
Морфометрические изменения респираторного отдела при гипероксии дают основания говорить о негативном влиянии ГС с 40%-ным содержанием кислорода на состояние легких. Это подтверждается снижением общего объема альвеол, площади альвеолярной поверхности, что ухудшает эффективность процессов газообмена.
Коллаген и межальвеолярные перегородки
Окраска по Ван-Гизону не выявила существенных различий в количестве коллагеновых волокон между контролем и группой гипоксии.
На рисунке 1 показаны микропрепараты лёгких: А — контроль, Б — воздействие гипоксической смеси, В — гипероксической смеси. Масштаб изображения дан в мкм.
При гипероксии количество коллагеновых волокон в респираторном отделе существенно увеличилось. Больше всего их было вокруг РБ и кровеносных сосудов, меньше — в МП (рис. 1).
МП состоит из эпителиальных слоев альвеол, подэпителиальных базальных мембран, сетки капилляров, а также эластических, ретикулярных и коллагеновых волокон [13] . Толщина МП в легких контрольных животных в среднем составляла 6,7 мкм. После вдыхания гипоксической ГС толщина МП имела тенденцию к снижению. А после 28 сеансов воздействия гипероксической ГС отмечалось достоверное увеличение толщины МП – на 46 % по сравнению с контрольной группой (рис. 2). Рост толщины МП может быть связан с разрастанием соединительнотканных волокон в ней. Это приводит к изменению скорости газообмена и вентиляции легких [13] .
Оксипролин как маркер соединительной ткани
Коллаген – структурный компонент СТ. Его характерной особенностью является высокое содержание оксипролина (12–14 %). Это позволяет считать оксипролин специфическим маркером коллагена, по концентрации которого можно судить о скорости катаболизма коллагена. Определение концентрации оксипролина часто используют для оценки состояния СТ в различных органах [10].
У животных 2-й группы выявлено достоверное снижение концентрации оксипролина в ткани легкого на 21 % по сравнению с контрольной группой. Снижение концентрации оксипролина может свидетельствовать об усилении деструкции или торможении синтеза коллагена. Другими исследователями показано увеличение концентрации оксипролина и десмозина, экспрессии генов коллагена и фактора роста в ткани легких под воздействием гипобарической [14] и нормобарической гипоксии (2 % кислорода) [15] . По-видимому, различная степень гипоксии и атмосферного давления создает возможность и других реакций.
После воздействия гипероксии (40 % кислорода) была отмечена тенденция к повышению концентрации общего оксипролина. Это согласуется с данными других авторов и может свидетельствовать об увеличении общей массы СТ в легких (см. рис. 2) [6].
Зависимость ответа от режима и возраста
Реакция организма на действие гипероксической ГС зависит от уровня РО₂ и длительности его воздействия. Вначале она направлена на приспособление к новым условиям: снижается частота дыхания, объемы легочной вентиляции и циркулирующей крови в легких. С увеличением РО₂ и удлинением экспозиции развиваются патологические процессы, вплоть до отека легкого [16] .
Показано, что у новорожденных крысят, вдыхавших в течение 1 нед. ГС с 95%-ным содержанием кислорода, а в последующие 2 нед. – ГС с 60%-ным содержанием кислорода, повышалась как концентрация коллагена, так и экспрессия гена коллагена 1-го типа [17]. У кроликов, вдыхавших ГС с 90%-ным содержанием кислорода, наблюдалось увеличение размеров и уменьшение количества альвеол. При этом плотность коллагеновых фибрилл снижалась, а эластиновых – не изменялась [6].
Установлено, что аэрогематический барьер легких у животных раннего возраста более чувствителен как к недостатку, так и к избытку кислорода во вдыхаемой ГС [5] . Так, после воздействия гипоксической ГС (11 % кислорода) у 2-недельных крыс развивались изменения в ультраструктуре аэрогематического барьера, приводившие к его утолщению. При дыхании гипероксической ГС (90 % кислорода) в течение 30 мин обнаружено еще более значительное утолщение аэрогематического барьера, увеличение проницаемости капилляров легких, чего не было отмечено после вдыхания ГС с 40%-ным содержанием кислорода. У взрослых животных подобные изменения после аналогичных воздействий гипо- и гипероксии были менее выражены [4] .
Заключение
Выводы эксперимента
Гипоксическая газовая смесь (10 % кислорода), подаваемая в прерывистом режиме, приводит к увеличению воздушности легких и общей площади альвеолярной поверхности, снижению количества элементов СТ, что способствует повышению эффективности газообмена.
В заключении авторы описывают уменьшение среднего диаметра альвеол на 20 %, глубины — на 21 %, площади поперечного сечения — на 43 % при 40 % кислорода. Также отмечено уменьшение ширины входа в альвеолу. Толщина МП выросла на 46 %, количество коллагеновых волокон и концентрация общего оксипролина — на 10 %. Это трактуется как возможное увеличение массы СТ и ухудшение диффузии кислорода.
Примечание редакции: в выводе оригинала режим гипероксии назван прерывистым, тогда как методы описывают ежедневную подачу в течение 60 мин. Эти формулировки не позволяют приравнивать эксперимент к чередованию фаз IHHT у человека.
Данные исходной публикации
Полные таблицы, иллюстрации и формулировки авторов доступны в исходном PDF. Ссылки ниже открывают соответствующие страницы оригинала.
Морфометрические показатели: страница 2 исходного PDF
Гистологические иллюстрации: страница 3 исходного PDF
Технология и применение
В работе сравнивали отдельные воздействия. Чередование кислородных фаз в IHHT описано в самостоятельном разделе. Подробнее о технологии IHT и IHHT.
Литература
Источники 1–8
1. Порівняльні дані про розповсюдженість хвороб органів дихання і медичну допомогу хворим на хвороби пульмонологічного та алергологічного профілю в Україні за 2008–2009 рр. / Линник М.І., Недоспасова О.П, Антонечко Л.Ф. та ін. Київ; 2010.
2. Есипова И.К.Патологическая анатомия легких. М.: Медицина; 1976.
3. Березовський В.Я., Янко Р.В., Чака О.Г. та ін. Вплив гіпоксичної газової суміші саногенного рівня на реактивність легень щурів різного віку. Вісник Львівс. ун-ту. Сер. біол. 2012; (59): 227–234.
4. Коваленко Т.Н. Состояние аэрогематического барьера легких в условиях нормальной и измененной газовой среды у крыс разного возраста: Автореф. дис. … канд. биол. наук. Киев; 1984.
5. Розова К.В. Вплив нормо- та гіпобаричної гіпоксії на ультраструктуру тканини легень і міокарда. Фізіол. журн. 2008; 54 (2): 63–68.
6. Mascaretti R.S., Mataloun M.M., Dolhnikoff M. et al. Lung morphometry, collagen and elastin content: changes after hyperoxic exposure in preterm rabbits. Clinics (Sao Paulo) 2009; 64 (11):1099–1104.
7. Окуяма К., Джианг Д., Айхара К.Ультраструктурные изменения в легких на фоне гипоксической терапии: оценка терапевтической эффективности как разновидности импульсной терапии. Пульмонология 2004; (4): 67–71.
8. Березовский В.А. Природная и инструментальная оротерапия. Донецк: Заславський; 2012.
Источники 9–17
9. Літовка І.Г. Кісткова тканина в умовах дефіциту навантаження. Київ: Інформаційно-аналітичне агентство; 2011.
10. Коржевский Д.Э., Гиляров А.В. Основы гистологической техники. СПб.: СпецЛит; 2010.
11. Вейбель Э.Р. Морфометрия легких человека: Пер. с нем. М.: Медицина; 1970.
12. Kurt R.S., Maria G.F. Hypoxia-induced pulmonary vascular remodeling. Circ. Res. 2006; 99: 675–691.
13. Widmaier E.P., Raff H., Strang K.T. Human physiology: The mechanisms of body function. Boston: McGraw-Hill Higher Education; 2003.
14. Estrada K.D., Chesler N.C. Collagen-related gene and protein expression changes in the lung in response to chronic hypoxia. Biomech. Model. Mechanobiol. 2009; 8 (4): 263–272.
15. Falanga V., Zhou L., Yufit T.Low oxygen tension stimulates collagen synthesis and COL1A1 transcription through the action of TGF-beta1. J. Cell. Physiol. 2002; 191 (1): 42–50.
16. Fu Y.Q., Liu C.J., Li J. et al. The expression of a-smooth muscle actin during the lung injury induced by hyperoxia. Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue 2012; 24 (10): 616–619.
17. Jiang J.S., Lang Y.D., Chou H.C. et al. Activation of the renin-angiotensin system in hyperoxia-induced lung fibrosis in neonatal rats. Neonatology 2012; 101 (1): 47–54.